TERAPIA EPIGENÉTICA EN LAS ENFERMEDADES CARDIOVASCULARES

 Tema: Regulación epigenética en la arterosclerosis.

Mecanismo epigenómico tratado: Metilación de histonas.

Cómo se hizo: Se hizo en   los sitios de metilación de lisina mejor comprendidos incluyen H3K4, H3K9, H3K27, H3K36, H3K79 y H4K20, las lisinas en las histonas pueden estar mono, di o trimetiladas (Kme, Kme2, Kme3). PRC2 (Polycomb Repressed Complex 2) posee actividad histona metiltransferasa. EZH2, una subunidad importante de PRC2, puede agregar un grupo metilo a H3K27 y EZH1.

Resultados:   Respuesta inflamatoria que incluye la activación de NF-kb, generación de especies reactivas de oxígeno(ROS) y apoptosis de células endoteliales. NF-kB induce una respuesta al estrés oxidativo, activa citoquinas como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF) y moléculas de adhesión como ICAM-1 y VCAM-1 en la superficie endotelial y promueve la transmigración de leucocitos, la acumulación de monocitos y la proliferación de células del músculo liso; resultando en la formación de placa aterosclerótica.

Figura 1. Representación de las principales modificaciones en las histonas. Disponible en:https://www.elsevier.es/es-revista-clinica-e-investigacion-arteriosclerosis-15-articulo-epigenetica-arteriosclerosis-S0214916815000546

Referencia bibliográfica:

1. Discoverymedicine.com. [citado el 25 de febrero de 2024]. Disponible en:https://www.discoverymedicine.com/Chunli-Wang/2021/02/epigenetic-regulation-in-atherosclerosis/

TÉCNICAS DE EDICIÓN DE ACIDOS NÚCLEICOS EN LAS ENFERMEDADES CARDIOVASCULARES.

 Edición genética in vivo CRISPR-Cas9 para Amiloidosis por transtiretina

Tipo de edición:  In vivo/somática

Dirigido hacia:   Proteína transtiretina (TTR)

Dirigido por:  CRISPR/Cas9 - ARNm para la proteína Cas9 y ARNguía único(sgRNA) dirigido TTR.

Órgano a tratar: hepatocitos

Vía de administración:  Infusión intravenosa

Resultados: Pemite reducir la producción de proteína TTR.  A largo plazo pretende adaptarse para tratar otras enfermedades con una simple sustitución del sgRNA.

Figura1. Edición genética in vivo CRISPR-Cas9 para Amiloidosis por transtiretina.Obtenido de: https://andradebalear.es/wp-content/uploads/2021/12/nejmoa2107454.pdf

Bibliografía:

1.  Gillmore JD, Gane E, Taubel J, Kao J, Fontana M, Maitland ML, et al. CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis. N Engl J Med [Internet]. 2021;385(6):493–502. Disponible en:https://andradebalear.es/wp-content/uploads/2021/12/nejmoa2107454.pdf

CÉLULAS MADRE EN EL TRATAMIENTO DE LAS ENFERMEDADES CARDIOVASCULARES

 

Cardiopatch tecnología de vanguardia para la reparación del infarto de miocardio

Tipo de célula madre: Células madre mesenquimales.

Método de obtención:

1. Las células madre se obtienen del tejido adiposo con micro-ARNs y vectores virales.
2. Una vez modificada la célula mesenquimal en el laboratorio se combina con los cardiomiocitos (se obtiene mediante la reprogramación de fibroblastos) gracias a la membrana de colágeno se unen.
3. El parche de fibras está compuesto de colágeno funcionalizado con proteínas terapéuticas  de tipo pro-angiogénico y cardioprotector.
4. Se desarrolla un dispositivo 3D enrollable para lo cual se emplea máquinas de impresión 3D para que la implantación sea mínimamente invasiva en el paciente.
5. El parche se introduce a tráves de una pequeña insición  y se dirigirá a la zona dañada del corazón una vez allí se acoplara  y desplegara en la lesión cardíaca para activar la regeneración

Vía de administración:  Toracotomía(Incisión quirúrgica de la pared torácica)

Resultados:

• Corto:Observar si el parche cumple con la función de regenerar el área lesionada y sus posibles efectos.
• Mediano: En aproximadamente en un año su primer hito es  generar los distintos modelos de parches y los primeros prototipos de sistemas 3D para el cultivo, transporte del parche y la creación de un modelo enrollable.
• Largo: ofrecer una solución definitiva con infarto de miocardio un "parche inteligente" capaz de regenerar la lesión cardíaca e impulsar la I+D+i.

Figura N°1: Prototipo multi-sense Cardiopatch. Obtenido de: https://www.researchgate.net/figure/Multi-Sense-CardioPatch-prototype-a-and-its-explosion-view-b-1-cover-of-the-main_fig1_308537865

Referencia bibliográfica:

1. CARDIOPATCH, tecnología de vanguardia para la reparación del infarto de miocardio.[Internet].[consultado el 10 de febrero del 2024]. Disponible en: https://www.immedicohospitalario.es/uploads/2021/10/cardiopatch_tecnologia_vanguardia_26119_20211026122942.pdf

 

ADN Recombinante

 

Ácidos nucleicos recombinantes en la naturaleza 

La conjungación bacteriana requiere el contacto celular directo(material genético) por medio de los plásmidos que solo poseen genes del grupo tra. Ejemplo : factor de fertilidad o plásmido F de coli.

Figura 1: Conjugación. Obtenido de: https://es.khanacademy.org/science/ap-biology/gene-expression-and-regulation/mutations-ap/a/genetic-variation-in-prokaryotes

ADN recombinante artificial

1. Tema: Producción de plásmidos recombinados para su uso como controles de la técnica de RT-PCR para el diagnóstico de los virus Chinkungunya y Zika.

2. Objetivo: Producir plásmidos recombinantes para obtener secuencias clonadas del virus Chikungunya (CHIKV) y Zika (ZIKV).

3. Gen o secuencia a clonar: ADN a partir del ARN (CHIKV(548pb) y ZIKV(192))

4. Enzimas de restricción: fueron cortadas a partir del gen correspondiente a cada agente viral.

5. Enzima ligasa: T4 ADN ligasa.

6. Vector: plásmido comercial pGEM-T Easy (Promega)

7. Célula receptora: Procariota Ecoli XL1-Blue MRF.

8. Método de inserción del gen: Transformación por choque térmico.

9. Método de identificación de clones: Cultivo -PCR- Espectrofotometría.

Figura 2: Ligación y transformación del plásmido recombiante. Obtenido de:  https://repositorioinstitucional.buap.mx/server/api/core/bitstreams/6377f4b7-c0e8-4c0b-b30d-6d5d2dd2b31b/content

Referencia bibliográfica:

1. "Conjugación"-conjugación [Internet ].Estudio.estudio;2019[consultado el 4 de febrero del 2024].Disponible en: https://www.studocu.com/es-mx/document/universidad-nacional-autonoma -de-mexico/bioquimica-experimental/conjugacion-conjugacion/7494289

2.  De Malariología B,Ambiental S, Nathaly A, Mayora Hernández, Luis G, Medina Pestana, et al. Producción de plasma recombinantes para su uso como controles de la técnica RT-PCR para el diagnóstico de los virus Chikungunya y Zika.2020[consultado el 4 de febrero del 2024 ];1:30-7. Disponible en: https://docs.bvsalud.org/biblioref/2023/09/1509551/41-108-1-pb.pdf

PRUEBA DE HIBRIDACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO DEL VPH

La muestra se obtiene mediante un cepillo que se introduce en el canal endocervical las células se someten a una solución alcalina desnaturalizante que exponen al material genético después se hace uso de un cóctel de sondas de ARN para los 13 tipos de VPH-AR en presencia de cualquiera de los tipos se forma un híbrido ADN viral-ARN. La hibridación se identifica mediante anticuerpos específicos y la solución quimio-luminiscente, para el revelado de los híbridos se requiere un luminómetro, la lectura final permite reportar la prueba positiva cuando hay emisión de luz o negativa cuando no la hay. 

Figura 1: Detección de VPH mediante el sistema de hibridación:  https://www.diagnosticsnews.com/productos-y-tecnologias/27364-tecnolab-qiagen-deteccion-de-hpv-de-alto-riesgo-mediante-el- sistema-de-captura-de-hibridos

REFERENCIA BIBLIOGRAFICA 

1. TEST DE VPH EN ESTRATEGIA DE SCREENING PRIMARIO PARA DETECCIÓN DE CÁNCER CERVICO UTERINO [Internet ]. [consultado el 27 de diciembre de 2023]. Disponible : https://www.argentina.gob.ar/sites/default/files/informe-11-test-vph-marzo-2021.pdf 

TÉCNICA DE PCR (REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA) PARA LA DETECCIÓN DE CANDIDIASIS HUMANA

TEMA: Nueva reacción en cadena de la polimerasa múltiple para el diagnóstico específico de especies implicadas en la candidiasis humana. 

OBJETIVO: Diseñar y optimizar una técnica de reacción en cadena de la polimerasa múltiple (PCR) considerando parámetros termodinámicos para la detección simultánea de cinco especies de Candida relevantes en la etiología de la candidiasis humana.

MUESTRAS: muestras sanguíneas de pacientes con hemocultivos positivos para Candida spp.

TIPO DE ÁCIDO NUCLÉICO: ADN genómico

EXTRACCIÓN(LISIS, SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN): estuche comercial QIAamp ADN Mini Kit (Qiagen).

GENES A ANALIZAR: se utilizaron la región transcrita interna 2 (ITS2) (AJ249486.1) para C.albicans y la topoisomerasa II (TOPII) para C. parasilopsis(AB049144 .1), C. krusei (AB049139.1), C. tropicalis (ABA049141.1) y C. guillermondii (AB049145.1).

TAMAÑO EN PAR DE BASES: C. albicana(206pb), C. guillermondii(244pb), C.tropicalis(474pb), C.parasilopsis(558pb) y C. krusei(419pb).

 

TIPO DE PCR: PCR múltiple, 30 ciclos.

PASOS:

DESNATURALIZACIÓN: 94 °C durante un minuto.

ALINEAMINETO O UNIÓN DE CEBADORES:53 °C durante 50 segundos.  

EXTENSIÓN: 72 °C durante 80 segundos.

ELECTROFORESIS O VISUALIZACIÓN:

Figura 1: Electroforesis en gel de agarosa al 1.3% de los productos de la PCR múltiple para la identificación de Candida ssp.Marcador de peso Gene Ruler 1kb DNA Ladder (Invitrogen) .

BIBLIOGRAFÍA:

1.

García LT, Luna LJ, Velasco TK, Guerra BE. Nueva reacción en cadena de la polimerasa múltiple para el diagnóstico específico de especies implicadas en la candidiasis humana. Biomédica [Internet]. [consultado el 17 de diciembre de 2023];37(2):200–8. Disponible en: https://www.redalyc.org/journal/843/84350981010/html/

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ALTERACIÓN EPIGENÉTICA DE LA INSUFICIENCIA CARDÍACA

Además las alteraciones de la expresión de los miARN afectan directamente a la expresión de los ARNm diana, ya que los miARN se expresan en cardiomiocitos, fibroblastos controlando al sistema cardiovascular a la vez el desequilibrio de los miARN son potencialmente causantes de la enfermedad. 

Imagen 1: Representación de los diferentes mecanismos de excreción (o secreción) de los miARN celulares. Disponible en:  https://dspace.uib.es/xmlui/bitstream/handle/11201/145985/Garcia_Jesus.pdf?sequence=1

Referencia bibliográfica 

1.   Chávez A, Co, Osmar C, Alfonso C, Antonio O. Esta obra está bajo una Licencia Creativa Comms Atribución 4.0 Internacional Rev salud pública Parag [Internet ].2020.[consultado el 10 de Diciembre de 2023 ];10(1 :74-9. Disponible en:  https://docs.bvsalud.org/biblioref/2020/04/1087935/pag-74-79.pdf